Síntesis de Virus

El título de mi tesis de pregrado fue “Implementación de un Sistema Lentiviral para la Transducción e Incorporación Efectiva de constructos de DNA en la Línea Celular U937”. Suena bastante complejo, en realidad fue un proceso de estandarización, porque habíamos tratado de silenciar genes en los monocitos U937 y no lo habíamos logrado de ninguna manera. ¿Para qué? La forma de verificar siempre si una proteína tiene una función relevante en algún proceso biológico es silenciarla (manipulamos la célula para que no la exprese más y observamos qué pasa) y sobre-expresarla (manipulamos la célula para que exprese grandes cantidades de la proteína blanco y observamos qué pasa). El proceso hacía parte de un proyecto grandísimo que todavía está en curso y varias personas del grupo habían intentado ya incorporar un constructo de ADN en los monocitos. Esa fue mi tesis, sin silenciar, sin sobre-expresar, solo modificarlas efectivamente y ver que no se murieran. Estas células en cultivo son bastante susceptibles.

El proceso de incorporar ADN a una célula se llama transfección, hay diversos métodos y funcionan con alta eficiencia para algunos tipos celulares. Cuando se realiza en bacterias se llama transformación. La manera de comprobar si la transfección tiene éxito es utilizando un gen reportero, esto es, una secuencia de ADN que codifica para una proteína fluorescente llamada GFP. Si después de unos días de la transfección las células brillan, se mide la eficiencia y si esta es alta, se implementa esa metodología para utilizar con el gen de interés. Sin embargo, estas células literalmente no aceptaban el ADN, la máxima eficiencia que se obtuvo con varios métodos fue del 3%...nada. Evidentemente, en este caso fracasamos olímpicamente. Mi director dijo entonces que la única manera sería utilizar virus. Ahí se decidió que esa sería mi tesis.

Los virus que utilizamos son lentivirus, una subfamilia de los retrovirus, como el del VIH. Y bueno, ¿qué es un virus? ¿está vivo o no? Esa pregunta no tiene respuesta “oficial”, a mis alumnas se les enseña que no en el colegio, pero lo cierto es que los virus - así como los priones - son un punto intermedio extraño y difícil de explicar. Un virus NO es una célula, no tiene núcleo, ni organelos, pero sí tiene información genética y una cápside de proteína para protegerlo y algunos incluso se “roban” la membrana celular de la última célula que infectaron. En ese caso, el objetivo es usarla como un disfraz, sirve para engañar al sistema inmune que podrá detectar la membrana como parte del organismo y no lo atacarán. El material genético puede ser ADN o ARN, codifica entre otras cosas para las proteínas de la cápside y para poder expresarse, debe aprovecharse de la maquinaria que tiene una célula normal, por eso las infectan.

Los retrovirus llevan su información genética como ARN y una enzima que es capaz de retro-transcribirlo a ADN. Una vez dentro de la célula ocurre la retro-transcripción y el ADN que resulta se incorpora en el genoma de la célula hospedera, permanecerá ahí siempre. Por eso el VIH se presenta en las generaciones posteriores. Los lentivirus funcionan de la misma manera, por lo cual si queremos incorporar ADN de manera estable a una célula, son una excelente opción.

Así las cosas, la manera de sintetizar los lentivirus es bastante fácil. Tengo dos o tres constructos de ADN (llamados plásmidos) que codifican para las proteínas estructurales (es decir, las de la cápside) y para la transcriptasa-reversa entre otras cosas (el kit se compra, vienen así aunque hay muchas opciones y uno debe saberla elegir), además de un plásmido adicional que tiene mi gen de interés. Utilizo esos tres plásmidos para trasfectar unas células adherentes, que reciben fácilmente el procedimiento y ellas serán mi “fábrica de virus”. Esas células expresarán como proteína los dos primeros plásmidos conformando la cápside y replicarán el tercero dejándolo como el ARN que irá dentro de esas cápsides. Los virus ya formados salen al medio, el cual colecto en varios momentos dentro de las 96 horas posteriores a la transfección. Finalmente y lo más pronto posible, utilizo esos virus para infectar la línea celular que me interesa, para el caso de mi tesis las U937. En ese momento, logré una efectividad del 40%, pero el grupo siguió trabajando y hoy en día conseguimos el 100%. Ya con eso, podemos avanzar para silenciar o sobre-expresar un gen de interés. Y bueno, suena más sencillo al narrarlo, pero experimentar tiene sus pormenores. Ahí vamos.